Ante el aumento de las infecciones producidas por algunos patógenos como Campylobacter, E. coli, productor de toxina Shiga (STEC), y Salmonella y, la alarmante presencia de microorganismos resistentes en ganadería, hay numerosas iniciativas que se han puesto en marcha para buscar alternativas a los antibióticos convencionales de uso veterinario. En este marco, en AINIA estamos desarrollando una librería de anticuerpos con formato reducido (Nanobodies) como herramienta para incrementar la seguridad en el sector ganadero. Te contamos las aplicaciones y los pasos que estamos siguiendo para lograr desarrollar estos nanoanticuerpos.
Existe una gran preocupación a nivel internacional sobre las Zoonosis y su impacto en la salud humana. Las infecciones más frecuentes son causadas por bacterias Gram-negativas como Campylobacter y Salmonella, pero además recientemente están aumentando las infecciones por algunos grupos de patógenos como Escherichia coli, que es productor de toxina Shiga (STEC). La detección temprana de estos patógenos es crucial para prevenir y controlar brotes, y así evitar que lleguen hasta el consumidor.
Además, es necesario desarrollar nuevas alternativas a los antibióticos de uso veterinario, puesto que el empleo descontrolado de antibióticos, en los últimos años, ha provocado una alarmante presencia de microorganismos resistentes, que en consecuencia nos ha llevado a una situación de extremada vulnerabilidad frente a las infecciones bacterianas. Los formatos reducidos de anticuerpos, que estamos desarrollando en el proyecto NANOBAC, se generan a partir de librerías sintéticas en levadura, y buscan ser la solución tanto en la detección temprana como una alternativa a los antibióticos convencionales.
Producción de nano-anticuerpos en levaduras frente a diferentes bacterias del sector ganadero
El objetivo principal del Proyecto NANOBAC, que estamos desarrollado en AINIA en cooperación con el Laboratorio de Amparo Pascual-Ahuir Giner de la Universidad Politécnica de Valencia, es la Lbasados en VHHs (Siglas en inglés de “Variable heavy of Heavy chain antibody”), el formato más pequeño de anticuerpos funcionales existente, como herramienta para incrementar la seguridad en el sector ganadero mediante dos aplicaciones diferentes:
- Para prevenir enfermedades gastrointestinales en crías de granja: En primero lugar, los nanoanticuerpos se pueden utilizar para prevenir enfermedades gastrointestinales en crías de granja. Tras el destete, los animales quedan expuestos a un amplio repertorio de bacterias que pueden causarles infecciones graves, reduciendo su bienestar y generando pérdidas económicas al sector. Para ello, los nano-anticuerpos pueden ser incorporados en la dieta de las crías de manera rutinaria, confiriendo protección frente a las infecciones más habituales y problemáticas. Una dieta enriquecida en anticuerpos frente a estos patógenos podría utilizarse como sustitutivo de antibióticos y otros agentes antimicrobianos, proteger al ganado y prevenir la dispersión de estas enfermedades en las granjas.
- Para reducir los tiempos de detección y controlar posibles brotes: Por otro lado, estos mismos nano-anticuerpos pueden ser utilizados como moléculas activas para la generación de sensores portátiles o sistemas de detección temprana de patógenos con el objetivo de reducir los tiempos de detección y controlar posibles brotes reduciendo la presencia de los patógenos en la cadena alimentaria.
El diseño de esta nano-herramienta estará basado:
- En primer lugar, la selección de una colección de anticuerpos con formato reducido (VHHs) frente a cada uno de los tres de los patógenos más problemáticos en la industria ganadera: Campylobacter, coli productor de toxina Shiga (STEC), y Salmonella.
- En segundo lugar, se está llevando a cabo el estudio del formato más adecuado de anticuerpo mediante diseño genético avanzado,
- En tercer lugar estas colecciones de anticuerpos están siendo producidas en la levadura Pichia pastoris, que mediante su secreción al medio de cultivo.
Los 4 pasos que estamos siguiendo para lograr desarrollar nanoanticuerpos
Os describimos a continuación los pasos que estamos siguiendo para lograr desarrollar nano-anticuerpos.
- Generación de proteínas antigénicas
La correcta elección de los antígenos bacterianos es clave para este tipo de abordaje, puesto que, si se pretende inhibir a los patógenos, las secuencias proteicas de las VHH deberían tener una afinidad fuerte hacia las proteínas proteínas de membrana. Para ello hemos seleccionado tres proteínas de membrana exterior de Salmonella typhi y generado una secuencia sintética con todas las características necesarias para los experimentos de cribado tras la expresión en E.coli de cada una de las proteínas.
- Selección de secuencias a partir de una colección naïve de anticuerpos.
Tras la generación de las proteínas antigénicas se utilizaron como “anzuelo” para seleccionar los anticuerpos con mayor afinidad a partir de una librería de VHHs integrada en una plataforma Yeast Surface Display. Esta plataforma contiene más de 109 VHH, cada uno de ellos producido de forma individual y expuesto al exterior gracias a su anclaje con componentes de la pared celular.
Tras exponer la librería a las proteínas antigénicas producidas, se aislaron las células que producían VHH de mayor afinidad mediante MACS (Magnetic-activated cell sorting) y posterior FACS (Fluorescence-activated cell sorting). Tras la generación de colecciones de VHH aisladas con mayor afinidad, se procedió a su secuenciación para conocer las secuencias genéticas de los VHH.
- Generación de un vector de expresión específico para nano-anticuerpos mono y bivalentes.
VHHCombi es un conjunto de herramientas fácil de usar compuesto únicamente por dos vectores, es decir, pUPS y pGGKai, y un enlazador, especialmente diseñado para clona nano-anticuerpos mono y bivalentes. Ambos vectores se basan en la estrategia de clonación Golden Gate utilizando enzimas de restricción tipo IIS que separan unos pocos nucleótidos de su sitio de reconocimiento.
El número de nucleótidos está definido y es dependiente de cada enzima, lo que resulta en “overhangs” cortos que pueden ser diseñados por el usuario para servir como límites de ensamblaje sin fisuras entre los diferentes fragmentos de ADN. Además, estos “overhangs” se pueden estandarizar para dar identidad a cada tipo de fragmentos para que puedan intercambiarse fácilmente cuando se desee, permitiendo de esta manera ahorrar costes en la síntesis de ADN a la hora de generar colecciones de anticuerpos.
- Generación de un diseño genético de formato mono y bivalente
Cada una de las secuencias obtenidas está siendo utilizada para generar anticuerpos mono- y bi-valentes tras su clonaje en el vector de diseño propio descrito en el apartado anterior para su expresión en la levadura Pichia pastoris. Tras la generación de ambos formatos se llevará a cabo una comparativa para descifrar que tipo de formato es potencialmente más adecuado para su uso como aditivo alimentario y/o como molécula para detección de patógenos en biosensórica.
Para ello se llevarán a cabo pruebas in vitro para la evaluación de la actividad y de las posibles sinergias entre diferentes anticuerpos de las mezclas. Además, será necesaria la optimización, escalado y definición de las etapas downstream del proceso de producción, tareas que se llevarán a cabo a lo largo de la segunda etapa del Proyecto.
NANOBAC, proyecto que cuenta con el apoyo de la Agencia Valenciana de la Innovación (AVI)
Este proyecto “Producción de pequeños formatos de anticuerpos en levaduras frente a diferentes bacterias del sector ganadero” (NANOBAC) ha sido financiado por la Agencia Valenciana de la Innovación (AVI) con el programa “Proyectos Estratégicos en colaboración para los ejercicios 2021 a 2023”. Expediente INNEST/2021/294
